12月7日，中国科学院上海免疫与感染研究所晁彦杰研究员在国际学术期刊Nature Communications发表了题为In vivo RNA interactome profiling reveals 3'UTR-processed small RNA targeting a central regulatory hub的研究论文。该研究开发了一项全新的RNA互作组高通量研究技术（iRIL-seq），使用该技术能在微生物活细胞内快速鉴定RNA-RNA分子间相互作用，在转录后水平发现新的基因调控机制。该研究首次绘制了沙门氏菌不同生长时期的RNA互作网络图谱，发现了许多新型非编码RNA和重要的mRNA调控中枢。
细胞内RNA-RNA互作是非编码RNA发挥功能的核心机制之一。在原核微生物细胞中，非编码小RNA通过十分简短且不完美的碱基互补配对识别靶标mRNA，其分子互作难以使用常规方法进行准确预测与鉴定。原核非编码小RNA具有重要的调控功能，在转录后水平控制众多靶基因的翻译表达，在细菌感染致病、抗生素耐药、营养代谢、压力应激、群体感应与生物膜合成等许多生物学过程中发挥着关键作用，因此解析RNA-RNA互作网络对于研究微生物生理生化与非编码RNA功能机制有重要意义。然而，现有的RNA-RNA互作组研究技术实验体系复杂、步骤繁多、周期长且失败率高，需要固定细胞后在体外进行RNA末端酶切、修复与连接等上百步操作，RNA互作鉴定的准确性和分辨度不足。
该研究开发了一种全新的体内RNA邻近连接技术iRIL-seq（intracellular RNA interaction by ligation and sequencing）。该技术通过在微生物活细胞中诱导表达T4 RNA连接酶，促使RNA-RNA互作分子之间发生邻近连接；借助非编码小RNA结合Hfq伴侣蛋白的特点，使用免疫共沉淀富集Hfq和与之结合的众多非编码小RNA及其互作分子；最终通过高通量测序鉴定所有捕获的RNA分子与序列特征，主要实验流程可在1天内完成。该技术既实现了对微生物RNA-RNA分子互作网络的全景式解析，也能在单核苷酸水平鉴定RNA-RNA碱基互作位点信息，具有高度的灵敏性和特异性，为解析不同微生物中的RNA互作图谱提供了一种简单、快捷、准确的通用性技术，也为研究真核细胞中的RNA分子互作提供了新的思路。
图1：微生物活细胞RNA邻近连接技术iRIL-seq实验流程
利用iRIL-seq技术，该工作首次绘制了肠道模式病原菌—沙门菌多个生长时期的动态RNA互作网络图谱，鉴定了2000多个RNA-RNA互作关系，首次提出了mRNA调控中枢的概念，证明编码外膜桶蛋白OmpD的mRNA是目前规模最大的调控中枢，至少受到12个不同非编码小RNA的调控。进一步对这些小RNA进行实验鉴定，发现了一个经mRNA 3’UTR剪切加工产生的新型小RNA FadZ。FadZ及其亲本fadBA mRNA的表达受到上游转录因子FadR、CRP和长链脂肪酸信号的调控。在长链脂肪酸条件下，FadZ sRNA与其靶基因ompD均由转录因子CRP激活，共同构成I型不连贯前馈回路（I1-FFL），拓展了细菌应对宿主长链脂肪酸代谢压力的转录后调控机制。
图2：iRIL-seq鉴定的ompD mRNA调控中枢和新型小RNA FadZ的功能机制
晁彦杰研究员为该论文的通讯作者，复旦大学上海医学院王川副教授为共同通讯作者；中国科学院上海免疫与感染研究所博士后刘方为论文第一作者，联合培养研究生陈梓滢为论文共同第一作者。该工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、中国科学院战略性先导科技专项、中国科学院国际合作局、上海市科技重大专项、中国博士后基金会等项目支持。
文章链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-43632-1
课题组介绍:
微生物RNA系统生物学研究组（负责人：晁彦杰研究员）以人体重要病原菌和共生菌为研究对象（如肠道沙门菌、肺炎克雷伯菌等），利用独特的高通量测序技术和功能基因组实验方法，鉴定新型的非编码小RNA、RNA结合蛋白并解析其功能与机制，加深对微生物感染致病、耐药持留、宿主互作和共生机制的认识。课题组主持承担多项国家级人才与科研项目，在Nature, Mol Cell, Nature Comm, EMBO J, EMBO Mol Medicine, Trends in Microbiol, Emerging Microb & Infections等国际期刊发表30多篇高水平论文，引用超过6000次。
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