Nat. Com. | 王程远研究组合作揭示Rof蛋白调控沙门氏菌毒力的分子机制

4月15日，中国科学院上海免疫与感染研究所王程远研究员与晁彦杰研究员、复旦大学生物医学研究院陈振国教授、军事科学院军事医学研究院高月研究员团队合作，在Nature Communications上发表题为“A widely conserved protein Rof inhibits transcription termination factor Rho and promotes Salmonella virulence program”的研究论文，首次阐明了Rof蛋白抑制Rho因子依赖型转录终止，并调控沙门氏菌毒力因子表达的分子机制。该研究为深入研究致病菌毒力因子表达调控机制提供了新线索，为抗菌药物研发提供了新靶点。

Rho因子依赖型转录终止（Rho dependent transcription termination）是普遍存在于细菌中的一类转录终止机制。与固有转录终止不同，Rho因子依赖型转录终止主要通过具有5′ ->3′转移酶/解旋酶活性的Rho因子完成RNA聚合酶转录终止过程，同时与转录翻译偶联过程相互协作，在细菌应激基因表达、外源基因沉默、毒力因子调控、维持基因组稳定性等过程起着重要调控作用。细菌Rho因子依赖型转录终止过程主要包括四个步骤：1）Rho解旋酶形成开环状态（Ring state）六聚体，并通过其初始RNA结合位点（Primary binding site，PBS）识别信使RNA上的特殊序列（Rho utilization site，rut site）并与信使RNA结合；2）开环状态Rho六聚体通过其中心位置第二个RNA结合位点（Secondary binding site，SBS）与富含嘧啶RNA序列结合；3）开环状态六聚体闭合形成闭环六聚体（Ring state），并通过水解ATP提供能量沿着5’->3’方向在信使RNA上移动；4）Rho解旋酶六聚体接近延伸状态RNA聚合酶，并通过NusG转录因子介导与RNA聚合酶结合，通过水解ATP提供机械力解离信使RNA与RNA聚合酶，最终完成RNA聚合酶的转录终止过程。王程远研究组在此前的研究过程中成功解析了转录因子NusG介导细菌转录翻译偶联（Science 2020）以及Rho因子依赖型转录终止（Nature 2023）的分子机制，阐明了其相互协作调控基因表达的工作模型。然而，细菌中Rho因子依赖型转录终止过程是否还受到其它因子的调控仍未明确。

Rof（又称为Rho off）是一类在细菌中高度保守的调控蛋白，在此前的研究中被报道具有抑制Rho因子依赖型转录终止的功能，然而其抑制作用的具体分子机制并不明确。本研究通过体外结合实验，证明Rof蛋白能与Rho因子直接相互作用；之后通过单颗粒冷冻电镜方法解析了大肠杆菌Rof-Rho抗转录终止复合体结构（分辨率为2.8Å）。结构显示Rof能特异性地与Rho因子初始RNA结合位点结合，竞争性抑制Rho因子识别并结合信使RNA中的rut序列，进而抑制Rho因子六聚体由开环状态向闭环状态转变，最终导致Rho因子无法完成转录终止过程。

研究发现，Rof蛋白普遍存在于肠杆菌目（Enterobacterales）、奈瑟菌目（Neisseriales,）和伯克霍尔德菌目（Burkholderiales）中，特别是在肠杆菌目中，其氨基酸序列高度保守。通过体外转录实验证明，肠杆菌目沙门氏菌中的Rof蛋白与大肠杆菌Rof具有相似的功能机制，可有效抑制沙门氏菌Rho因子依赖型转录终止。沙门氏菌作为重要的食源性致病菌，能够表达多种毒力因子，主动侵入真核宿主细胞内寄生繁殖。通过分析沙门氏菌毒力基因表达和细胞侵染效率，本研究揭示了沙门氏菌Rof因子通过抑制Rho因子依赖型转录终止，调控了多个毒力因子相关基因（hilA，prgH和sopB）的转录活性，最终促进了沙门氏菌III型分泌系统的表达组装和入侵宿主细胞的能力。该研究为进一步解析致病菌毒力因子调控提供了重要研究基础。

图：Rof蛋白抑制Rho因子依赖型转录终止，调控沙门氏菌毒力因子表达的模式图

中国科学院上海免疫与感染研究所博士后张晶为论文第一作者，上海免疫与感染研究所博士生张硕、军事科学院军事医学研究院副研究员周维、复旦大学博士生张翔为论文共同第一作者。该工作得到国家重点研发计划、国家自然科学基金、上海市科技重大专项等项目支持。

文章链接：https://www.nature.com/articles/s41467-024-47438-7